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源葉生物 / 2015-05-08
目的
1．了解稀釋法分離土壤微生物的原理。
2．學(xué)習(xí)并掌握由土壤分離細(xì)菌和真菌的方法。
3，掌握有目的分離有益微生物的原理和技術(shù)。
原理
土壤是微生物棲居的大本營，各種各樣的微生物都雜居在一起。當(dāng)我們需要某種微生物時，即可通過提供適宜的營養(yǎng)條件，或添加只利于所需菌生長而抑制其它菌生長的抑制劑，有選擇地將所需菌分離出來，這種技術(shù)即稱為微生物的分離與純化。稀釋法常用于分離土壤、各種水域及基物表面的微生物。其原理是：先將土壤樣品進(jìn)行一系列倍比稀釋，然后將幾個適當(dāng)濃度的稀釋液均勻涂布于分離培養(yǎng)基表面。經(jīng)培養(yǎng)后，土壤中的單個微生物細(xì)胞或孢子即可在培養(yǎng)基表面形成肉眼可見的菌落。再將所需菌落轉(zhuǎn)入試管斜面,然后經(jīng)平板劃線再次取得單菌落后，即可得到所需菌種的純菌株。因此，本方法的最大特點(diǎn)是可以對土壤樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時，如果采用選擇性培養(yǎng)基，可以分離到目的菌株。其全過程見圖24-1。
本方法分離土壤微生物具有一定的局限性，首先，由于采用平板培養(yǎng)，絕對厭氧的微生物不宜在平板上生長，如果需要分離厭氧微生物，還需要厭氧操作裝置。其次，采用的幾種培養(yǎng)基不一定能適于土壤中所有的微生物生長，特別是那些目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物。本實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)菌、放線菌和真菌的最適培養(yǎng)基，對各大類微生物進(jìn)行分離和活菌計(jì)數(shù)。
本實(shí)驗(yàn)還針對可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物而設(shè)計(jì)了選擇性分離培養(yǎng)基。分別根據(jù)分離目的設(shè)計(jì)出相應(yīng)的篩選模型。制備含有不同底物的培養(yǎng)基平板，將稀釋的土壤懸液涂布，或?qū)⒎蛛x到的菌株直接點(diǎn)接在選擇性平板表面，置適宜溫度培養(yǎng)后，可通過肉眼觀察來判斷目的需要的目的菌株。
材料
1．樣品：過篩（孔徑約2mm）的新鮮土壤樣品（使用前先測定含水量）。
2．培養(yǎng)基：在300ml 三角瓶中分別分裝150ml 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏1 號培養(yǎng)基。
3．選擇性培養(yǎng)基：纖維素酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)基 （選做）
4．滅菌物品：250ml 三角瓶分裝90ml 無菌水（內(nèi)含20-30 粒玻璃珠），18×180mm 試管分裝9ml 無菌水，培養(yǎng)皿，1ml 吸管，玻璃刮鏟。
方法

1．制備土壤稀釋液：用小天平稱分別稱取少時潮濕的菜園土和風(fēng)干的菜園土各10g，置于90ml 含玻璃珠的無菌水中，震蕩10min，靜置30 秒后，即得土壤原液（10－1）。再用1ml 無菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 無菌水中，充分搖勻，即得（10－2）稀釋液。依次類推，潮濕土制得10－1 至10－6 稀釋液； 風(fēng)干土制備10－1 至10－4 稀釋液；

2．分離：
（1）細(xì)菌的分離（基內(nèi)接種）
a.．取9 個無菌平皿，用1ml 無菌吸管分別吸取0.1ml 10－4、10－5 及10－6 潮濕土的土壤稀釋液，接入平皿，每一稀釋度設(shè)3 個重復(fù)，
b．將已融化并冷卻至45℃左右的細(xì)菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15ml，共9 個平皿，與菌液充分混勻，凝固后，在平皿上作好培養(yǎng)基種類、稀釋度、組號及日期標(biāo)記；
c．將平板倒置，37℃培養(yǎng)2~3 天后觀察并計(jì)數(shù)。