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常規(guī)傳代細胞培養(yǎng)

細胞復蘇

從液氮儲存罐中取出一支凍存的細胞種子，迅速放入36℃~40℃水中，快速解凍細胞，待細胞中完全解凍后用離心機1500rpm/min離心5min，超凈工作臺中棄去凍存管中的上清液，加入1ml 細胞生長液輕輕吹打混勻，轉入底面積為35cm2的細胞培養(yǎng)瓶，補加 8ml 的細胞生長液，前后左右混勻后于含5% CO₂的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-10h，貼壁率達70%以上時換液，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至單層。

 

細胞傳代培養(yǎng)

復蘇的細胞長至致密單層時，在細胞間超凈工作臺中進行傳代。

①   棄去細胞瓶中培養(yǎng)液，并用 1×PBS 洗兩次，每次 5ml（動作溫和，防止細胞脫落）；

②   加入 1ml 細胞消化液，完全浸潤細胞表面 15s，棄瓶中消化液，倒置，放入 37℃恒 溫細胞培養(yǎng)箱中 10min

③   細胞完全消化后（細胞面疏松，輕拍細胞瓶，細胞完全脫落即完全消化），加入 5ml 細胞生長液，用 10ml 的移液管反復吹吸（動作溫和，防止損傷細胞）制成單細胞懸液；

④   補加14ml 細胞生長液，混勻后分裝至兩個底面積35cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，于含5% CO2 的 37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其中一瓶用于接種CVB5 病毒，另一瓶細胞實驗備用。

 

細胞凍存

細胞貼壁率達到 80%-90%時，棄去細胞培養(yǎng)液，用 1×PBS 輕洗兩次，棄去 PBS，按上述細胞傳代中消化細胞的方法進行消化，待細胞消化完全時加入細胞凍存液來終止消化，輕輕吹打混勻，調整細胞濃度為 5×106 /ml，分裝至細胞凍存管，體積為 1ml/管，密封。按以下順序 4℃，1h；-20℃，1.5h；-40℃，1h；-80℃，過夜；第二天將其放入液氮罐中，完全浸沒于液氮，長期凍存?zhèn)溆谩?

 

各種原代細胞培養(yǎng)

①     取組織，放入平皿中。用PBS液洗組織2～3次。

②     剪碎胚體，用PBS液振蕩洗滌，靜置片刻，待胚塊沉淀后吸去上清，重復3次。 

③     加胰酶（終濃度0.625%），置37℃消化至胚塊“起毛”（大組織塊邊緣似纖毛運動）。

④     加入含小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，用滴管反復吹打至見不到組織塊。 

⑤     用200目細胞篩過濾至離心管中，離心10 min。

⑥     棄上清，加入少量生長液吹散細胞沉淀，加適量生長液，分裝入細胞培養(yǎng)瓶，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。