WB實驗指南

樣品制備：

變性條件——SDS Loading Buffer直接裂解：

用常溫或者高溫預(yù)熱過（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會改變）的5×SDS LB按比例加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。如果SDS LB不夠，樣品蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)現(xiàn)吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住槍頭。這時候常規(guī)做法有兩種，1. 再煮5min。常規(guī)煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續(xù)WB的意義，請丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）

此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

 

非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實類似）

裂解細(xì)胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。

使用溫和裂解液裂解（配方：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and 0.5mM PMSF）。

此方法的優(yōu)點：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時染色體會析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細(xì)胞。

 

組織塊裂解：

組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。

當(dāng)組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是

1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。

2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。

3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。

樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過的樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS 4度就會沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會）。

 

在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計。細(xì)胞樣品可以先計數(shù)再接種，短時間內(nèi)即使細(xì)胞生長有差異也不會對WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。

 

蛋白電泳：

電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經(jīng)驗之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒有嘗試過）。

電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點，保證最快速度完成電泳（電壓會逐漸增大），省時且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過快時會發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。

 

注意事項：

1．聚丙烯酰胺的30%母液會降解，要4度避光保存。

2．APS會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右。-20度分裝長期保存。

3．注意Tris buff的PH值，以及平時所用的水的PH值。PH值改變會使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時涌動極緩慢，位于膠中上部）

4．上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。

5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒洗凈的另一個壞處是，由中學(xué)物理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時會產(chǎn)生微小的錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時的錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤滑）。

6．上樣時，不要把槍頭深入膠孔過深（或者采用細(xì)的尖端拉長的專用上樣槍頭），可能會錯開膠和玻板，樣品會泄露。

7．未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會拉寬變形。通常20μl樣品（含4μl 5×SDS LB），可用8μl 5×SDS LB平衡。同理，點marker的lane也要加入同樣體積的LB。LB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會有差異，在新舊LB靠近的地方，條帶會拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。

8．增加上樣量不一定會提高熒光信號強(qiáng)度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因為增加上樣量最多只能提高幾倍，而WB靈敏度是以10的幾次冪量級的，所有目的蛋白信號的唯一方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個壞處是，本來高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。

仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDS LB通常都是投入200μl（最少80μl，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時上樣量要控制在5-6μl，最少2.5μl，最多10μl，10μl時內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對WB結(jié)果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶都很丑。

9. 不同樣品上樣時，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15μl，剛好+4μl 5×SDS LB達(dá)到常規(guī)20μl上樣體積；后者第8點提到只上4μl，同樣+4μl SDS LB（比重同，不會互相擠壓），最好補(bǔ)加10μl DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用“空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應(yīng)加入8μl 5×SDS LB），這樣才能確保每條帶都很美觀。

 

10. SDS PAGE膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長期4度保存。

 

轉(zhuǎn)膜

很多時候新手會把WB結(jié)果無信號歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實際上轉(zhuǎn)膜效率對最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識別能力的強(qiáng)弱，以及如何正確使用抗體，。

有一個簡單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測沒有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒有很好的策略可以解決這個新濾紙的問題；嘗試過浸泡（會泡爛的）、預(yù)電泳（會稍微好點）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會爛掉的），晾干再用；只要沒沖爛可以一直反復(fù)使用。

其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對較長，所以每個步驟的疊加作用會被級數(shù)放大，因此在試驗的每個步驟我們?nèi)詴η蟾谩?span>

 

轉(zhuǎn)膜方法有半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)，這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最佳，但靡費試劑、溶液，對普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時間長于半干轉(zhuǎn)（下文會具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個相對標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會選擇長時程的濕轉(zhuǎn)，而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來就是高手在懸崖上跳舞，此時轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒有任何意義——我說過轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果不起決定因素。

濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請參考分子克隆，有必要指出的是，實際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（≤5次常規(guī)1hr電轉(zhuǎn)，如有3hrs長時程轉(zhuǎn)染，緩沖液使用次數(shù)會減少），不過要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質(zhì)剩余不多，為確保轉(zhuǎn)膜溫度，可開始或中途更換新鮮轉(zhuǎn)膜液）。電轉(zhuǎn)液中SDS增加蛋白的水溶性，促進(jìn)蛋白在電轉(zhuǎn)液中泳動。若不加SDS，蛋白會沉淀在膠上，但SDS過多會影響蛋白與膜的吸附。甲醇能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為20%，但PVDF膜截留marker上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮提升甲醇的濃度至25%（它對普通蛋白的轉(zhuǎn)膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋白轉(zhuǎn)印可考慮降低甲醇濃度，另外SDS必須添加。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點對半干轉(zhuǎn)緩沖液的意義較大，因為半干轉(zhuǎn)緩沖液消耗很慢，緩沖液放置的時間較久，甲醇揮發(fā)比較嚴(yán)重，可臨時少量補(bǔ)加。

 

濕轉(zhuǎn)一般采用穩(wěn)壓，電壓控制在120-140V，時長1-3h（小蛋白控制在1h，大蛋白3h）；半干轉(zhuǎn)一般穩(wěn)流，依millipore PVDF膜附帶說明書，當(dāng)2.5-3mA/cm2，電壓25V（biorad半干儀額定值不能超過25V；amersham半干轉(zhuǎn)儀，限壓30V。通常跑不到這么大的電壓，除非是新的濾紙或很久的轉(zhuǎn)膜液，或常溫放置的轉(zhuǎn)膜液，或超大的膠），時間一般15--45min（常規(guī)用0.5h）；如果是3mA/cm2，時間不要超過0.5。這兩款儀器的限壓要求，可能出于保護(hù)儀器的目的；amersham為防止過載，當(dāng)電壓>30V，～35V附近的時候，保險會自動跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3h以后，最大電壓仍為18V（因此足見其散熱性能的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時間的要求是針對PVDF膜的，這里面有一個很有趣的問題。盡管廠家一再表明PVDF膜比NC膜對蛋白的截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高，所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對小分子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很容易穿過PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮增加marker的上樣量）；NC膜沒有這種問題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時間也是小蛋白1h、大蛋白3h，電流控制在200-300mA（16cm×9cm大膠300mA，如果膠面積小很多可以考慮降低，實際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看來是它的強(qiáng)度：干燥的膜易碎。當(dāng)然目前某些廠家為解決這個問題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強(qiáng)度和PVDF膜類似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時候要特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22μM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也不是一定必須。

 

對于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本建議采用低濃度膠，如6% SDS-PAGE。但實際操作發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非采用壇子上有人提過的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個人經(jīng)驗認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都可以勝任，可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。

 

轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒有具體要求，但用預(yù)冷過的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前-20度預(yù)冷，時間不能長于2h，否則電泳液凍結(jié)。

制作轉(zhuǎn)膜三明治的過程中，書中強(qiáng)調(diào)過濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒有膠、膜隔開部分的濾紙會因為直接接觸而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實際上濾紙大一些也不太要緊，通常膜的大小會嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點點。操作時在保證每一層均無氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個來回，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會被拉伸，條帶會扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加的時候每一層都無任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖?，對于蛋白分子的大小而言，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬倍計的，因此更緊密的接觸無疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。

 

膠和膜需不需要泡呢？不少公司實驗講座時提出泡膠、泡膜，實際操作中沒有發(fā)現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾些緩沖液會有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。

 

抗體孵育

——WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個脾氣。

對WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。無論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異，而抗體的效價可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。

 

封閉最短可以縮減到5min：

很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實這也是沒有吃透WB（說實話，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無語）；實際上封閉（極端點）也是個可有可無的步驟，真正對降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。當(dāng)你的抗體使用次數(shù)較多時，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新，其實封閉最短可以縮減到5min（沒試過更短的，不一定不可以）。那什么導(dǎo)致高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問題（增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可以不同；通常封閉液是最簡單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。

封閉很少出狀況。不過在脫脂奶做封閉劑的封閉液中，脫脂奶顆粒未完全溶解時，微小的顆粒會粘附在膜上增加星點狀背景。

 

緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗的關(guān)鍵首要在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價和背景的強(qiáng)弱，然而歷來商品化的抗體質(zhì)量參差不齊。抗體公司在出售抗體的時候，在廣告上會玩很多花樣。A.不給整張膜標(biāo)記的圖示。很多抗體質(zhì)量不好，背景高雜帶多，如果靶蛋白區(qū)域較干凈時，他們通常只給很窄的一條靶蛋白區(qū)域的圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)記的圖示，用IP的樣品取代。通過IP可以富集抗原，減少雜蛋白，通常很容易拿到背景很干凈，信號很強(qiáng)的圖例。C.用制備抗體時高表達(dá)的多肽做陽性樣品，不給全長蛋白的圖例。由于多肽可以IP富集，且不存在空間折疊的問題（通常裸露在外），因此很容易標(biāo)記。除以上花樣外，不少抗體用途上還有局限，因此挑選抗體時要睜大眼睛。

一抗通常4度過夜，效率較常溫1-1.5h高；二抗通常1:5000稀釋，室溫0.5-1h（過久并不會明顯提高信號強(qiáng)度甚至?xí)p弱（相當(dāng)于洗膜），同時造成高背景進(jìn)一步影響特異與非特異熒光信號強(qiáng)度間的對比。孵育時間過久還會迫使你延長TBST的時間，這對抗原識別能力較弱的抗體更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考慮高鹽洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜時間一般3×10min或者4×5min?？贵w孵育和洗膜時，搖床速度不能過快也不宜過慢，需要簡單摸索一下。

 

如何通過改變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最佳條件呢？

首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒有一個絕對通用的配方；一種抗體一個脾氣。

其次，抗體稀釋液的配方要兼顧與特異性抗體競爭抗原的強(qiáng)度，以及對其他區(qū)域的封閉強(qiáng)度兩方面的平衡。

目前，抗體稀釋液中可以充當(dāng)封閉蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的樣子。。?？墒?，你有沒有考慮過“復(fù)方”？——這下配方無限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的單方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根據(jù)實際情況改變（若出現(xiàn)白板，請降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過如果你翻翻抗體公司賣給你的原裝抗體里面液體的配方，你會發(fā)現(xiàn)很多抗體溶液里都有它。

2.很多情況下單方的濃度很高了，背景問題仍不能解決。那么請嘗試兩兩或者三種不同比例混合。不過有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA時，gelatin濃度不能無限提高（會完全競爭掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板），BSA的濃度較隨意。

3.抗體稀釋液可用低鹽濃度的TBST，也可用高鹽濃度的緩沖液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切記，有的抗體對鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。

如果以上策略仍然無法解決高背景，可將稀釋好的一抗先跟平時實驗剪切下來的membrane的邊角料（新的）放在一起孵育個把小時再用。如果還不行，徹底無解，結(jié)論抗體太差；請更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。

 

這三種封閉蛋白的差異：

milk和gelatin封閉效果不錯且價格便宜，但milk容易發(fā)霉變質(zhì)，且國產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會不會影響抗原抗體結(jié)合或者ECL??？）；BSA封閉效果不佳，且價格較昂貴。個人推薦gelatin，gelatin主要成分是骨膠原，蛋白很大，但可以通過加熱打斷成小蛋白，從而實現(xiàn)封閉各種分子量大小的蛋白。通常，我會將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過程中，不溶的gelatin會逐漸溶解；由于gelatin可以滅菌（milk不可以），所以同樣條件下，gelatin的存放時間明顯長于milk。實際上，抗體可以反復(fù)用很久（通常一般的抗體常規(guī)稀釋比，可以連續(xù)用一個月以上；對于老手用過2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價正是最高的時候），通?？贵w最后失效的原因不是因為使用次數(shù)過多，而是染菌；比較舊的抗體都會有很多的沉淀在底部，更長時間還會有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長使用時間；二抗不能加NaN3，但放在-20度反復(fù)凍融延長使用壽命（抗體并非絕對不可以凍融；只是高濃度的原始管抗體的凍融對效價會有較大影響）。

抗體稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不同）和封閉液可以相同，可以不同，因為抗體稀釋液可以采用復(fù)方的，所以即使混合了少許，不會對抗體的使用產(chǎn)生較大的影響。不過封閉液用milk時，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會影響其使用壽命。

由于以上諸多可變因素，實在無法總結(jié)出一種萬金油式的抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），因此對待具體問題時，請具體對待（多花點心思摸索吧）。

 

原裝抗體的保存：

1. 分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會有粘壁的損失，不是很推薦。

2. 1：1加甘油，凍于-20度，可長期保存，此方法實際上也被很多國內(nèi)的試劑公司廣泛采用，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查）。值得注意的是：不是所有的抗體都可以1：1添加甘油，要以抗體說明書為準(zhǔn)，如果說明書中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。

 

顯影

——淬滅的禍因

 

當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，目前國內(nèi)一些實驗室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所討論的某些細(xì)節(jié)問題可能不再出現(xiàn)。

首先壇子上還有少數(shù)實驗室處于DAB顯色時代，奉勸一句，都走到最后一步了就不要節(jié)省了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡述一下其原理：

交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成分，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過氧化物如雙氧水）。催化劑的作用不用廢話了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強(qiáng)弱。本人曾自制過ECL并嘗試改良，其間發(fā)現(xiàn)很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴于HRP濃度，熒光信號能瞬間曝強(qiáng)；這其實與下文提到的一些粹滅原因有聯(lián)系。

 

當(dāng)初我自制的ECL最大的毛病在于穩(wěn)定性不好，同理，商品化的ECL同樣也有保質(zhì)期的問題，往往最先失效的組分就是過氧化物，盡管他們必然添加過抗還原劑。其實，檢驗ECL是否失效的方法很簡單，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。

商品化的ECL價格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等（注意，國產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過關(guān)，有兩種潛在的問題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個角來回拖動數(shù)次至ECL均勻（有的產(chǎn)品說明書要求孵育1min）。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。

 

哪些因素會影響熒光信號的強(qiáng)弱呢？（這部分實際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素部分重合）

1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒（也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時，我曾經(jīng)提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短的時間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。

b. 保鮮膜的化工原料或拉制過程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價的保鮮膜問題尤多。

目前，國產(chǎn)的就“妙潔”比較過關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。

如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。

2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過水會吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜完全干掉。某些信號較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會消失；較好的試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。

3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時，包裹保鮮膜時要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過度消耗，呈線條狀淬滅。

4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號的強(qiáng)弱，這有利于判斷實驗可能出現(xiàn)的問題。很多人提問看見很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號）造成的；有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應(yīng)該問題不大，而問題主要是淬滅。如果你省略這個步驟，那問題就非常復(fù)雜了，因為之前任何操作都可能導(dǎo)致白板，根本無法判斷。

 

除上述的問題以外，還有哪些因素會導(dǎo)致熒光淬滅呢？

1. 抗原濃度太高，熒光信號過強(qiáng)，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過，如果上樣量太大，不僅條帶會粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。因為局部區(qū)域過多的HRP酶會快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會發(fā)現(xiàn)一條明顯的暗黃色的帶），熒光信號會閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實，則可能是顯影液接近失效）。

2. 抗原濃度太低，熒光信號太弱，相對慢一點的淬滅?？赡艿谝淮螇浩軌颢@得很弱的條帶，隨后都不可見。

3. ECL試劑質(zhì)量。除過氧化物因接觸空氣被逐漸還原外，ECL的成分通常都不穩(wěn)定。如呈遞電子躍遷能的中間遞質(zhì)其化學(xué)性質(zhì)就不太穩(wěn)定，因為它轉(zhuǎn)換能量的特性決定其必是一個有中間態(tài)的化合物，長期接觸空氣會被逐漸氧化失效；luminol也有保質(zhì)期。

4. 操作時間過長，膜逐漸徹底干掉。商品化的ECL會出現(xiàn)波形漸變，開始信號逐漸增強(qiáng)，背景一起升高；隨后熒光完全衰減淬滅。